食物中主要成分的测定：蛋白质与氨基酸的测定

一、意义

二、测定方法

1、凯氏定氮法(经典法，AOAC方法)

2、双缩脲法(比色法)

3、紫外吸收法

4、考马斯亮蓝法

5、茚三酮法

6、近红外光谱法

凯氏定氮法(GB方法、国际标准)

1、适用范围：所有动植物样品

2、原理

蛋白质中的有机氮经消化后成为无机氮,通

过测定无机氮的含量，折算出蛋白质的含量。

此法测定的是粗蛋白含量

3、测定方法

样品消化

2NH2(CH2)2COOH + 13浓H2SO4

(NH4)2SO4 + 6CO2↑ + 12SO2 ↑ + 16H2O

其中浓H2SO4的作用

1) 脱水性

2) 氧化性

蒸馏和吸收

(NH4)2SO4 + 2NaOH =2NH3 + Na2SO4

+2H2O

2NH3 + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 5H2O

(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O=

NH4Cl+ 4H3BO3

指示剂 甲基红-溴甲酚绿

酸性 紫红色

中性 灰色

碱性 绿色

4、计算

根据标准 HCl 的消耗量，计算出

总氮量，用公式算出蛋白质含量。

C×(V1-V2)×0.014

蛋白质%= ———————————× F × 100

m

式中 C——标准HCl浓度

V1——样品消耗HCl体积

V2——空白消耗HCl体积

m——样品质量

F——折算系数

0.014——氮的毫摩尔数

折算系数 F

小麦粉及制品 5.70

大豆及制品 5.71

乳及乳制品 6.38

畜禽肉及制品 6.25

蛋 6.25

玉米 6.24

大米 5.95

小麦 5.83

小和

红外

红外消化炉

5、仪器设备

凯氏定氮仪

凯氏定氮仪

6、操作要点及注意事项

样品均匀，且不要粘在管壁上，样品量适当。

硫酸钾(提高沸点)

硫酸铜(催化剂和指示剂)、硒粉(催化剂)

消化时温度应由低到高

蒸馏时，氢氧化钠要过量

蒸馏时，防止氨气逸散

消化不澄清时，冷却，可加入数滴 H2O2

硼酸吸收液温度不宜超过40℃

需做空白试验

7、凯氏定氮法的优缺点

优点

操作简单，可用于所有食品的测定

实验费用低

结果准确

缺点

不是直接测定蛋白质中氮

实验时间相对较长

精度较差，需做平行

试剂有腐蚀性

* 挥发性盐基氮的测定

是评价动物性食品新鲜度的主要卫生指标

挥发性盐基氮遇弱碱性氧化镁即被游离

而蒸馏出来，用半微量定氮法测定

双缩脲比色法(AOAC法)

1、原理

蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结

构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜可生成紫

红色的复合物，吸收波长为540nm，比色

所测得的消光度值与蛋白质含量成正比。

2、实验过程

3、应用

谷物、肉类、大豆、饲料等作物种子蛋白

4、注意事项

• 有脂类物质存在时，会产生混浊，需脱脂

• 加入CuSO4时要剧烈搅拌，以防Cu(OH)2 ↓

• 该方法不是测绝对值的方法，需用凯氏法校正

或用已知浓度的蛋白质做标准曲线校正

紫外吸收法

1、原理

由于蛋白质分子中存在着含有共轭

双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具

有紫外吸收的性质，波长在280nm。在

此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值

与其浓度成正比可作定量测定。

2、应用

牛乳、肉制品等，蛋白质浓度在

0～1g‧L-1 范围内。

3、注意事项

当样品中含有其他紫外吸收物质时，

会出现较大干扰

几种方法的比较

1、凯氏法适用范围广、操作简单、成本低、结果

较准确，但测定专一性稍差，时间相对较长，

试剂有腐蚀性。

2、双缩脲法速度快、成本低、方法简单易操作、

比较专一。比色时，样品处理不干净会有干扰。

3、紫外法快速、相对较灵敏、能保持蛋白质原有

性质，但要求样品体系纯净。